Larvicidal Activity of Native Bacillus thuringiensis Isolated from Soil Samples Of Nepal
Date
2024-01
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Abstract
Climate change is exacerbating the spread of mosquito-borne diseases globally. Vector control with Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) and Lysinibacillus sphaericus (Ls) the biological control agents for larval source management is an effective technique for preventing mosquito-borne diseases by focusing on mosquito larvae in diverse water sources. While these larvicides are used in many other countries, they are not widely available in Nepal for mosquito vector control. This study aims to isolate mosquito larvicidal Bacillus thuringiensis (Bt) from the soil samples collected in Nepal. It was isolated from the soil sample by the acetate selection method. It was identified by observing crystal protein stained by coomassie brilliant blue and further characterized by larvicidal assay and 16srRNA gene sequencing. The larvae were collected from the fields; and reared in the laboratory for the bioassay. Bioassay was carried out in four replicates with the positive control strain (coded as Bt-IPS-82), negative control, and test Bt. The mortality percentage was calculated after 24 hours. Formulated larvicide (Bt-14P2A) in the form of pellet and liquid suspension were evaluated in simulated and open field trials. The lethal concentration (LC), residual effects, and mortality rates were estimated. Bt isolates were isolated from 454 soil samples, with four strains (Bt-14P2A, Bt-7P1A, Bt-8P1A, and Bt-3P2B) demonstrating 100% larvicidal activity against mosquito larvae during primary screening. Bt-14P2A’s LC50 and LC90 against Ae. aegypti larvae in pellet form were 3.98 ppm and 25.11 ppm, respectively, whereas in liquid form they were 6.45 ppm and 37.15 ppm respectively. Simulated field testing revealed a residual impact of seven weeks for the liquid formulation, with 100% mortality for six weeks. Open-field experiments also showed efficacy, with very modest concentrations delivering 100% mortality for up to 14 days and residual effects lasting up to six weeks in household containers such as buckets. The obtained larvicidal Bt strains were found to be genetically identical to those in GenBank. In addition, 11 Ls isolates were isolated from 32 soil samples, one of which demonstrated mild toxicity against Ae. aegypti larvae. Finally, the efficient isolation procedure produced Bt strains with 100% larvicidal activity against Ae. aegypti larvae. These isolates show promise as future strategies for managing larval sources and combating mosquito-borne illnesses in Nepal.
जलवायु परिवर्तनका कारण लामखुट्टेबाट सर्ने रोगहरूको संक्रमण बढ्दै गईरहेको अवस्था छ । Malaria, Dengue, Japanese encephalitis आदि रोगहरू लामखुट्टेको माध्यमबाट सर्ने भएकाले यसलाई रोगवाहक (vector) भनिन्छ । लामखुट्टेको वृद्धि रोक्ने विधिलाई भेक्टर नियन्त्रण भनिन्छ । भेक्टर नियन्त्रण गर्न धेरै विधिहरू अपनाउन सकिन्छ । भेक्टर नियन्त्रणबाट लामखुट्टेको लार्भाका स्रोतहरूलाई कटौती गरेर वा नष्ट गरी वयस्क लामखुट्टेको वृद्धि रोक्न सकिन्छ । जैविक कीटनाशक जस्तै Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti), Lysinibacillus sphaericus (Ls) जस्ता ब्याक्टेरिया लाई पनि भेक्टर नियन्त्रणका लागि प्रयोग गरिन्छ‚ जसले पानीमा भएका लार्भा नष्ट गरी वयस्क लामखुट्टेको वृद्धि रोक्ने काम गर्दछ । विभिन्न मुलुकले लामखुट्टे नियन्त्रण गर्न जैविक कीटनाशक Bt र Ls को प्रयोग गर्ने गरेका छन् । जैविक कीटनाशकलाई विभिन्न प्रकार जस्तै तरल र ठोसकारूपमा उत्पादन गर्ने गरेका छन । यी जीवाणु मानव र अन्य जीवजन्तुका निम्ति हानिकारक हुँदैनन्‚ तर यिनले उत्पादन गरेका विषालु कीटनाशक क्रिष्टल प्रोटीनले लामखुट्टेको लार्भा नष्ट गरी तिनको स्रोत व्यवस्थापनमा सहयोग पुर्याउँदछ । यस अनुसन्धानको उद्देश्य नेपाली माटोका नमुनाबाट Bt र Ls को खोजी गर्नु र लामखुट्टे नियन्त्रणमा यसको प्रभावकारिता मुल्याङ्कन गर्नु हो । नेपालका विभिन्न वातावरणीय भूभागबाट माटो सङ्कलन गरी फरक फरक प्रविधिद्वारा माटोलाई प्रशोधन गरी Bt र Ls लाई छुट्याई सुरक्षित गरियो । यी दुई जीवाणुलाई सूक्ष्मदर्शक यन्त्र र coomassie brilliant blue (CBB) का सहायताले तिनीहरूको उत्पादन क्रिष्टल प्रोटिन अवलोकन गरी पहिचान गरिएको थियो । यस बाहेक छुट्याउन वा पहिचान गर्न अन्य प्रविधिहरू पनि अपनाइएको थियो । Bt र Ls को लार्भानाशक (Larvicidal) परीक्षण र Bt को16srRNA gene sequence बाट phylogeny को अध्ययन गरिएको थियो । लार्भानाशक क्षमताको परिक्षणका लागि काठमाडौँका विभिन्न स्थानबाट लार्भा सङ्कलन गरिएको थियो । प्रयोगशालामा पनि Aedes aegypti लामखुट्टेका लार्भा पालनपोषण गरिएको थियो । लार्भानाशक क्षमता परीक्षणका लागि विश्व स्वास्थ्य सङ्गठनको मापदण्ड अपनाइएको थियो । परीक्षण गर्दा लार्भालाई Bt का दुई प्रकारका उत्पादन जस्तै : ठोस र तरल जैविक लार्भानाशक (Bio-larvicide) खुवाइएको थियो । प्रयोगशाला र बाहिरी वातावरणमा तरल Bt-14P2A लार्भानाशकको परीक्षण गरिएको थियो । परीक्षणबाट सकारात्मक र नकारात्मक नियन्त्रणका साथै ५०% र ९०% लार्भालाई मार्न चाहिने मात्रा‚ (Lethal concentration dose LC50, LC90) मृत्यू प्रतिशत र प्रभावकारिताको निर्धारण गरिएको थियो । यस अध्ययनका क्रममा ४५४ माटोका नमुना परीक्षण गर्द । गोलाकार क्रिष्टल उत्पादन गर्ने Bt माटोमा प्रशस्त (५८.३३%‚ ८०८/१३८५) भएतापनि केवल चार Bt (Bt-14P2A, Bt-7P1A, Bt-8P1A, Bt-3P1B) को गोलाकार क्रिष्टल प्रोटिनले मात्र शत प्रतिशत (100%) लार्भालाई मार्ने क्षमता राख्ने देखाएको थियो । प्रारम्भिक जाँचका क्रममा Bt-14P2A ले सङ्कलित लार्भा र प्रयोगशालामा पालनपोषण गरिएका Aedes aegypti लामखुट्टेका लार्भा विरुद्ध LC50 ३.९८ र LC90 २.११ PPM देखाएको थियो । तरल बनाइए जैविक लार्भानाशक Bt-14P2A लाई Simulated field trial परीक्षण र खुला स्थलगत परीक्षण (Open field trial) मा प्रयोग गरिएका सबै मात्राहरूले २४ घण्टा भित्र शतप्रतिसत लार्भा नास गरेको थियो । खुला स्थलगत परीक्षणमा सबैभन्दा कम मात्राले १४ दिनका लागि वर्षाको पानी पुन:पूर्ति हुँदा शतप्रतिशत (100%) मृत्युदर देखायो । त्यसैगरी‚ घरेलु प्रयोजनका निम्ति प्रयोग हुने बाल्टिनहरूमा जैविक लार्भानाशकको छ हप्तासम्म residual effect देखिएको थियो । यसै क्रममा 16srRNA gene sequence को परीक्षणबाट ३ ओटै Bt जैविक लार्भानाशक हो भनी प्रमाणित भएको छ । केवल एउटा Ls ले Ae. aegypti लार्भा विरुद्ध २५% मृत्युदर देखाएको थियो । नेपालको माटोबाट पाँचवटा लार्भानासक व्याक्टेरिया (चार) Bt र (एक) Ls प्राप्त भएको थियो । तसर्थ‚ प्राप्त Bt द्वारा पानी भण्डारणका क्रममा भाँडामा हुर्किएका लामखुट्टेका लार्भा नष्ट गरी यसलाई नेपालमा लामखुट्टेबाट सर्ने रोगहरूको नियन्त्रणका लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।
Description
Keywords
Aedes aegypti, Bacillus thuringiensis, Bio-larvicide, Larval Source Management, Lysinibacillus sphaericus